Дипломная работа: Морфофизиологическое описание дрожжей медоносной пчелы

Содержание

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Распространение дрожжей в природе........................................................5
1.2. Дрожжи ассоциированные с насекомыми………………………..….. 10
1.3. Практическая значимость дрожжей…………………………………….14
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………..…....18
3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ……………...……... 22
3.1. Характеристика выделенных культур дрожжей……………….……... 22
3.2. Морфологические признаки …………………………………….......... 25
3.3. Культуральные признаки ………………………………………...…...... 30
3.4. Физиолого-биохимические признаки ..………………………………....31
3.5. Рост штаммов дрожжей на различных субстратах …………………. 39
ВЫВОДЫ……………………………….…………………. ………….........…. .43
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................................. 44
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространение дрожжей в природе.

Распространение дрожжей в природе определяется рядом факторов.
У дрожжей отсутствует фотосинтетический аппарат, поэтому их развитие непосредственно зависит от содержания в среде органических веществ. Способность дрожжей не только сбраживать сахара, но и усваивать многие источники углевода путем окисления увеличивает возможность их обитания в различных экологических нишах. Все известные виды дрожжей усваивают простые сахара - глюкозу, фруктозу, маннозу. Однако у многих дрожжей углеродное питание высоко специфично и часто связанно с их местом обитания. Это проявляется в способности окислять пентозы, метилпентозы, полилозы, многоатомные спирты, аминосахара, органические кислоты и некоторые другие органические вещества. Большинство этих соединения являются продуктами метаболизма растений и грибов, которые образуют их из предшественников, синтезируемых растениями /8/.
Известно, что дрожжи не могут фиксировать атмосферный азот. Наиболее подходящий источник азота для них аммонийные соединения. Многие виды способны утилизировать нитраты, мочевину, лишь немногие дрожжи усваивают нитраты, амины. Распространению дрожжей на растениях и в почве способствует присутствие насекомых-переносчиков, которые также используют многие из этих субстратов для размножения и питания. В то же время некоторые вещества, синтезируемые растениями, другими микроорганизмами или самими дрожжами могут ингибировать рост последних /9/.
По литературным данным на видовой состав дрожжей в природных субстратах могут воздействовать и киллерные токсины. Описаны дрожжи-киллеры с широким спектром действия. Так, киллерные токсины Рichia kluyeri активны против штаммов Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, C.krusei, C. рarapsilois, N.glabrata/10/.
Из других факторов окружающей среды селективное действие оказывают влажность, температура, величина pH, концентрация кислорода, солнечная радиация. Отмечено, что многие дрожжи, обитающие в филлосфере растений, способны продуцировать внеклеточные полисахариды, образуя капсулу, которая предохраняет клетку от высыхания. Среди литосферных дрожжей значительное место занимают виды, продуцирующие каротинойдные и меланиноподобные черные пигменты, которые выполняют защитную роль от действия ультрафиолетовых лучей /11/.
Важное селективное влияние оказывает температура, некоторые дрожжи могут расти в узких температурных границах. Например, психрофильные виды с оптимальной температурой роста около 5Со обитают главным образом в полярных наземных ареалах и полярных водах, термофильные виды с нижним пределом 20-28Со и высшей границей 48Со приспособились к обитанию в желудочно-кишечном тракте теплокровных животных /12/.
На видовой состав дрожжевых сообществ влияет концентрация кислорода. Дрожжи, ферментирующие сахара, развиваются обычно в глубоких слоях поврежденных тканей, в толще маринадов, силоса и др. В то же время дрожжи с окислительным метаболизмом преобладают в филлосфере растении, образуют пленку на поверхности маринадов /13/.
Количество дрожжей, обнаруживаемых в различных субстратах, и их видовой состав в значительной мере зависят от используемых методов выделения. Очень важна точная идентификация выделяемых дрожжей. Применение традиционных фенотипических признаков (утилизация различных источников углевода и азота.) т.е. признаков, часто кодируемых единственным геном, ответственным за определенный гидролитический фермент, в настоящее время считается недостаточным для видовой дифференциации /14/.
Применяются молекулярные методы. Молекулярную идентификацию штаммов проводят, используя метод анализа длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ) 5.8 S-ITS pДНК и ПЦР анализ /15/.
Исходя из литературных данных, наиболее обильно дрожжи развиваются в природных местообитаниях, как правило, локальных и недолговечных, в которых происходит накопление легкодоступных источников питания - простых сахаров, органических кислот и др. Аналогом таких природных сообществ может служить интенсивное развитие одной популяции сахаромицетов при сбраживании виноградного сока в традиционном виноделии. Непосредственной причиной этого является высвобождение большого количества сахаров при раздавливании ягод винограда. При этом преимущество получают именно быстрорастущие сахаромицеты, способные к быстрому, «взрывному» росту за счет малоэффективного бродильного метаболизма. В природе часто можно наблюдать похожие явления, когда растительные сахара в высокой концентрации становятся доступными для утилизации дрожжевыми грибами/16/.
Как видно, возникновение подобных местообитаний в основном сопряжено с локальными разрушениями растительных тканей, которые приводят к высвобождению содержимого клеток. Подобные явления довольно часто вызывают различные беспозвоночные: фитофаги, ксилофаги, микофаги. Этим и объясняется наблюдаемая связь аскомицетовых дрожжей и беспозвоночных животных. В ряде случаев могут возникать устойчивые коэволюционные ассоциации между определенными видами дрожжей и беспозвоночных, например, в галереях ксилофагов. Однако участвующие в таких ассоциациях виды дрожжей постоянно выделяются и из других типов субстратов.
В таких субстратах популяции отдельных видов дрожжей могут достигать очень высоких значений численности и даже доминировать в микробном населении. Многие из подобных природных местообитаний неоднократно привлекали внимание зимологов и служили источниками выделения самых различных видов дрожжей/17/.
Будучи гетеротрофами, дрожжи в природных экосистемах ассоциированы с другими организмами, в первую очередь с растениями. По данным Голубева В.И. четверть всех культур Всероссийской коллекции микроорганизмов выделена из филлоплана, растительных экссудатов или опада. Внутри этой категории преобладают (62%) эпифитные дрожжи; изоляты с растительных остатков и слизетечении составляют 21 и 17%. Выделенные из филлоплана организмы весьма разнородны, включая почти поровну аскомицетные и базидиомицетные дрожжи, принадлежащие не менее чем к 40 родам. Количество родов выделенных с растительных остатков и слизетечении в два раза меньше. В основном это представители родов Candida, Pichia, Nadsonia, Xanthophyllomyces/18/.
Распространение дрожжей в природе не ограничивается только локальными и недолговечными местообитаниями с высоким содержанием сахаров. Их можно выделить практически из любых природных сред, включая верхние и более глубокие почвенные горизонты, поверхность растений, растительные остатки, природные воды, воздух. Обычно численность дрожжей в большинстве таких местообитаний невысока и часто лежит на пределе чувствительности методов их учета. Роль дрожжей здесь значительно ниже по сравнению с ролью мицелиальных грибов и бактерий за исключением, может быть, живых частей растений. Многие виды аскомицетовых дрожжей, интенсивно развивающиеся в специфических сахаросодержащих субстратах, спорадически выделяются также из почв и с поверхности растений. Тем не менее, известны десятки видов дрожжевых грибов, для которых почвы, растения и растительные остатки являются основным местообитанием. Многие из таких видов представляют собой дрожжеподобные грибы базидиомицетового аффинитета, для цикла развития которых характерны дрожжевая анаморфная и мицелиальная телеоморфная стадии. Сахаролитическая стратегия у таких дрожжей выражена слабее, чем у представителей порядка Saccharomycetales. За немногими исключениями базидиомицетовые дрожжи не способны бродить и в среднем усваивают более широкий спектр соединений. Приуроченность таких дрожжей к местообитаниям с высоким содержанием свободных сахаров выражена слабее. Среди них много космополитических эвритопных видов, которые с одинаковой вероятностью выделяются из многих субстратов в различных географических зонах. Часто географические координаты (широта местности) служит более надежным предиктором варьирования таксономического состава дрожжей, чем доступные оценке физико-химические или экотопические параметры состояния почвы /19/.
Надземные части растений почти всегда заселены эпифитными микроорганизмами, среди которых значительную часть составляют дрожжи.
Численность и видовой состав эпифитных дрожжей закономерно изменяются в годичном цикле. Дрожжи практически отсутствуют на молодых весенних листьях. На листьях, завершивших период активного роста, численность дрожжей постепенно возрастает в течение осени, достигая максимума после установления снежного покрова, а затем снова снижается в весенний период. В состав эпифитного комплекса входят бактерии, мицелиальные и дрожжевые грибы, потребляющие растительные экссудаты, таким образом, выполняющие функцию эккрисотрофии /20/.
Для многих дрожжевых грибов филлосфера является наиболее обычной средой обитания. Одной из первых на эпифитную специализацию некоторых видов дрожжей обратила внимание новозеландская исследовательница М.Е. Ди Менна. К настоящему времени накоплен значительный материал по численности и таксономическому составу эпифитных дрожживых сообществ растении в различных природных зонах. Имеющиеся литературные данные позволяют выделить группу постоянно встречающихся в филлосфере видов. Наиболее часто с листьев различных растений выделяются дрожжи безидиомицетового аффинитета, такие как Cryptococcus laurentii, С.flavus, Rhodotorula fujisanensis, R. glutins. R mucilaginosa, R. graminis, Sporobolomyces roseus /21/.
Многие виды дрожжей особенно часто выделяются с поверхности растений и при этом имеют специфические морфологические и физиологические особенности, свидетельствующие об их приспособленности к существованию именно в этом типе местообитания. К таким особенностям относятся выраженная каротиноидная пигментация, защищающая клетки от солнечной радиации, образование активно отстреливающихся баллистоспор, рассеивающихся воздухом, формирование полисахаридных капсул, способствующих адгезии и предохраняющих клетки от высыхания. Дрожжи с таким сочетанием свойств относятся к экоморфологической группе фитобионтов /22/.
Дрожжи обитают в почвах всех географических и климатических зон в бедных, с естественной вегетацией (луга, пастбища, леса) и культивируемые человеком (сады, поля, огороды). Они содержатся в почвах с различным химическим составом и структурой, влажностью и рН. Дрожжи попадают в почву с различных наземных субстратов/23/.
Общее содержание дрожжей в почве значительно ниже чем бактерий и грибов. Численность их колеблется от 0 или нескольких клеток до 770 000 клеток в 1г почвы/24/.
По данным исследователей найбольшее количество культур выделенных из почвы относят к родам Torulopsis, Rhodotorula, Saccharomyces, Lipomyces. Представители рода Pichia, Candida, Hansenula, Schizoblastosporion и дрожжеподобных грибков Oidium немногочисленны /25,26/.
Многие виды дрожжей, обнаруживаемые на растениях и растительных остатках, могут быть выделены и из почвы. В верхних горизонтах обычны типичные фитобионты и сапробионты, изредка встречаются аскомицетовые дрожжи, характерные для рассмотренных выше очагов местообитаний с высокой концентрацией свободных сахаров. Эти виды составляют группу аллохтонных почвенных дрожжей. Они попадают в почву с опадом, переносятся беспозвоночными животными. По мнению многих авторов почва не является истинным местом обитания дрожжей, а лишь «ловушкой», местом сохранения или постепенного отмирания/27/.
Вскоре после открытия Пастером дрожжевой природы спиртового брожения было показано, что дрожжи постоянно обитают на поверхности ягод винограда и других сладких плодов. С этого времени было проведено множество исследований дрожжевого населения винограда и всех технологических стадий виноделия. Было установлено, что на свежих ягодах винограда, а также в только что приготовленном виноградном соке обычно доминируют дрожжи аскомицетового аффинитета Kloeckera apiculata (телеоморфа - Hanseniaspora uvarum), образующие лимоновидные клетки в результате биполярного почкования и неспособные к росту при повышенной концентрации этанола. Наряду с этим с ягод винограда выделяется много других видов дрожжей, как аскомицетового, так и базидиомицетового аффинитета. Основным источником сахаромицетов в процессах традиционного виноделия являются предметы оборудования винодельческих предприятий. Таким образом, Saccharomyces cerevisiae - это синантропный вид, предковые формы которого, тем не менее, сохраняются в природных очагах (так называемые «дикие дрожжи»)/28/.
Большинство видов изолированных из зрелых ягод клубники, малины и крыжовника принадлежало к родам Sacchoromyces, Candida, Torulopsis, Criptcoccus, Rhodotorula/29/.
Благоприятной средой для обильного размножения дрожжей является поврежденные или треснувшие ягоды, из которых вытекает сок, содержащий сахар. На зеленных незрелых ягодах, поверхность которых покрыта восковым налетом, дрожжи не находят питательных веществ и легко сдуваются ветром или смываются дождем в поверхностные слои почвы где под влиянием прямых солнечных лучей быстро погибают/30/.
Для дрожжей, часто способных питаться только простыми углеводами в высокой концентрации, важным условием успешного развития является своевременное попадание клеток на поврежденный плод. Поэтому особую роль в инфицировании высокосахаристых плодов аскомицетовыми дрожжами играют различные насекомые, питающиеся плодами или откладывающие в них свои яйца. Такие насекомые могут переносить дрожжевые клетки с одного плода на другой (форезия). При этом дрожжи, развивающиеся в плодах, могут даже служить для насекомых дополнительным источником питания/31/.
Кроме того, пыль, переносимая сильными ветрами через сады и виноградники может увлекать с собой и дрожжевые клетки. Брызги дождя, попадая на ягоды, расположенные близ почвы, могут переносить на них частицы почвы, следовательно, обогащать их дрожжами/32/.
Сокотечения, или весенний плач деревьев - это вытекание флоэмного сока из повреждений на стволе, например, у таких деревьев, как береза, клен, дуб и др. Выделяющийся сок со временем обильно заселяется микроорганизмами, среди которых преобладают бактерии и дрожжи. Такой забродивший сок привлекает многих насекомых, которые используют его в качестве питательного субстрата и служат эффективным средством переноса дрожжей на свежие субстраты.

1.2. Дрожжи ассоциированные с насекомыми

Приведенные выше примеры типичных местообитаний дрожжевых грибов объединяет одна интересная особенность: тем или иным образом в их формировании участвуют беспозвоночные животные. Более того, в кишечниках самых разных беспозвоночных также часто присутствуют дрожжи, среди которых есть как случайные, так и симбиотические формы, сопутствующие животному на протяжении всей его жизни. Такие дрожжи входят в состав сложных микробных ассоциаций, формирующихся в кишечном тракте беспозвоночных и играющих важную роль в их питании. Кроме упомянутых выше насекомых-ксилофагов такие симбиотические дрожжи были обнаружены в кишечниках многих ризо- и сапрофагов, например, кивсяков, мокриц, личинок пластинчатоусых жуков (бронзовка, майский жук), личинок жуков-щелкунов. Дрожжи, обитающие в кишечниках сапрофагов, представлены разными аскоспоровыми родами, такими как Debaryomyces, Williopsis, Torulaspora, а также анаморфами из рода Candida/33/.
Дрожжевые грибы постоянно обнаруживаются также в кишечниках и экскрементах различных беспозвоночных, питающихся зелеными частями растений (фитофагов), например, многих представителей равнокрылых, клопов, трипсов, жуков, гусениц бабочек и перепончатокрылых и др. Среди таких дрожжей обычны виды Metschnikowia reukaufii и Metschnikowia pulcherrima, обитающие в растительном нектаре. Также в субстратах, ассоциированных с зеленоядными беспозвоночными, часто обнаруживаются и другие виды аскомицетовых дрожжей из родов Candida, Debaryomyces/34/.
При значительном таксономическом разнообразии культур дрожжей, выделенных от насекомых, четко доминирующую часть представляют виды Pichia (Hansenula) и их анаморфы (Candida spp.), вместе составляющие 64% от общего их количества/18/.
Идеальным местом обитания дрожжей считаются цветы и особенно их нектарники. В тех случаях, когда опыление производится насекомыми, дрожжи с их помощью распространяются на растения- хозяева. Так как плоды развиваются из цветочных завязей, то цветы можно рассматривать и как один из первоначальных источников заражения плодов дрожжами.
По данным Шванвича Б.Н. на цветах обнаруживаются преимущественно аспоргенные дрожжи Candida reucauffi (Metshikowia reucauffi), C.guilliermondii, представители Kloeckera, Rhodotorula. По данным Луида, на цветках встречаются дрожжи Saccharomyces и Hansenula, но преобладают Torulopsis и Candida, менее часто выделяются виды Cryptococcus, Kloekera, Rhodotorula /35/.
Цветочный нектар может содержать сахара в концентрации до 20%, а также аминокислоты, органические кислоты, минеральные соли, представляя собой идеальную среду для развития дрожжей. Действительно, из цветков энтомофильных растений всегда выделяются дрожжи, среди которых можно обнаружить как типичные эпифитные виды, постоянно присутствующие и на других частях растений, так и специализированные формы. По-видимому, так же как и в случае сочных плодов, появление последних в значительной степени зависит от успешного инфицирования, за которое могут быть ответственны насекомые - опылители. Действительно, одни и те же виды дрожжей обнаруживаются как в нектароносных цветках, так и на их опылителях, в частности пчелах/36/.
Наиболее ранние исследования микрофлоры насекомых были посвящены изучению возбудителей болезней тутового шелкопряда и медоносной пчелы, затем патогенной микрофлоры вредных видов насекомых и, наконец, изучению нормальной микрофлоры.
Впервые итальянский исследователь Августино Басси установил, что мускардину тутового шелкопряда вызывает паразитический гриб, которому он дал название Botrytis paradossa. В 1849 году французский исследователь Герен-Меневиль описал возбудителя пебрины (нозематоза) тутового шелкопряда. Возбудитель болезни позднее получил название Nosema bombycis. Неоценимый вклад в изучение патогенной микрофлоры тутового шелкопряда внес Луи Пастер. Кроме того, Пастер описал другую болезнь тутового шелкопряда - фляшерию, вызываемую бактериями, среди которых он различал «вибрионы», «монады» и «круглые тельца, соединенные в цепочки»/37/.
Большой вклад в изучение бактериальных и вирусных болезней медоносной пчелы сделал американский исследователь Уаит. Он установил, что возбудителем американского гнильца пчел является Bacillus larvae, возбудителем европейского гнильца - Bacterium pluton и возбудителем мешотчатого расплода - фильтрующий вирус /38/.
Дрожжи и дрожжеподобные организмы, связанные с насекомыми, можно разделить на две категорий, в зависимости от того, являются ли они внутриклеточными или внеклеточными организмами по отношению к тканям хозяина /39/.....