Дипломная работа: Идентификация нефтеокиcляющих бактерий

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Углеводородокисляющие микроорганизмы
1.2 Микробная деструкция углеводородов нефти
и нефтепродуктов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.1. Питательные среды
2.3. Методы исследования
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Отбор активных нефтеокисляющих бактерий
3.2. Идентификация отобранных бактерий ……………………………….
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ……………………..
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ.

Общая характеристика.Микроорганизмы, использующие углеводороды широко распространены в природе.[5] Углеводородокисляющие микроорганизмы – составная часть гетеротрофного микробиоценоза. Присутствие углеводород усваивающих бактерий в окружающей среде – важный экологический фактор. В условиях увеличивающегося загрязнения экологическая роль этих микроорганизмов возрастает.[6]
Известно около 150000 видов микроорганизмов, из них более 100 видов способны использовать углеводороды нефти в качестве источника энергии.[7]. Микроорганизмы – деструкторы нефти в основном относятся к аэробным и факультативно аэробным организмам.[6] Там, где среда загрязняется нефтью, эти микроорганизмы находят благоприятные условия для своего развития.[8]
Экология.Углеводородокисляющие микроорганизмы распространены повсеместно в почве, воде, разлагающихся веществах и т. д.[9]
Микроорганизмы, потребляющие углеводороды нефти, являются обычными сочленами биоценозов почв.
Во всех почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять жидкие парафины и значительно реже – использующие летучие углеводороды. В почвах, содержащих нефть микроорганизмов, использующих н-алканы и ароматические углеводороды, находится значительно больше, чем в почвах без этих соединений.
Почва – весьма благоприятный субстрат для выделения микроорганизмов, использующих углеводороды нефти. В ней обитают бактерии, относящиеся к родам: Mycobacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas.
Для почв, содержащих нефтепродукты, характерно присутствие узкоспециализированных форм микроорганизмов: окисляющих газообразные углеводороды, термофилов, усваивающих твердые парафины, бактерий, использующих ароматические углеводороды.
Из почв, пропитанных нефтью впервые были выделены аэробные спорообразующие бактерии с оптимальной температурой роста 45 – 65°С, усваивающих углеводороды. Они принадлежат видам Bacillus subtilis, Bac.brevis, Bac. coagulans. Большая группа штаммов описана как новая разновидность – Bac. circulans ssp. thermophilus nov. ssp.
Из почв нефтяных месторождений (Западная Украина) выделены нафталинусваивающие бактерии, представлены в основном видами рода Pseudomonas: Pseud. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. boreopolis. По ряду свойств изолированные штаммы отличаются от типовых и обладают строгой специфичностью по отношению к нафталину как единственному источнику углеродного питания.
Из нефтеносных почв выделено свыше 20 видов аспорогенных дрожжей ( роды Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Torulopsis, Sporobolomyces, Trichosporon, Cryptococcus и др.)[5]
Тауссон сообщает о существовании микроорганизмов, окисляющих углеводороды в почвах пустыни. Там, где почва беспрестанно загрязняется нефтью, эти организмы находят благоприятные условия для своего развития, и большой процент общего количества почвенных микробов является активным.[7]
Бактерии и дрожжи, обладающие способностью усваивать парафины, обитают в ризосфере и филосфере растений, желудочно-кишечном тракте животных. Они выделяются из растительных материалов, подвергнутых биологическому консервированию.
Среди бактерий и дрожжей Квасников и др. обнаружили виды, обладающие способностью фиксировать азот атмосферы при использовании углеводородов в качестве единственного источника углеродного питания и энергии.
Микроорганизмы, окисляющие водороды широко распространены в воде и на дне морей. Скопление углеводородов при наличии благоприятных условий вызывает усиленное размножение микроорганизмов.
Наибольшее количество углеводородокисляющих микроорганизмов обнаруживается в теплое время года и может в 10 – 100 раз превышать количество сапрофитов, высеваемых на МПА. В холодный период года углеводород усваивающие бактерии обнаруживаются значительно реже.
Имеется тесная связь между видовым разнообразием, количеством нефтеокисляющих микроорганизмов и наличием нефтяного загрязнения в водоеме. В прибрежных водах морей, где нефтяное загрязнение постоянно, от 5 до 50% микроорганизмов способны окислять отдельные углеводороды и их смесь. Характер вертикального распределения углеводородокисляющих микроорганизмов также указывает на положительную корреляцию их численности с количеством нефтяных загрязнении, которое более значительное в портах и поверхностном слое воды. Углеводородокисляющие бактерии обнаружены в приатмосферном микрогоризонте Черного моря; зимой их 10² - 10³ клеток в 1 мл. В сильно загрязненных районах Черного моря содержание этих организмов достигает 10³ - 10 в 7 степени клеток в 1 мл.
Большое количество углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в грязи различных морских заливов и бухт.[7]
Численность микроорганизмов – деструкторов нефти не может служить количественным, а только качественным. В то же время численность углеводородокисляющих бактерий является фактором, ограничивающим скорость биодеградации. Чем больше численность углеводород усваивающих микроорганизмов, тем меньше требуется времени для их размножения и тем шире спектр углеводородов, подвергающихся окислению. Так, дополнительная инокуляция почвы микроорганизмами повышает биодеградацию дизельного топлива на 10 – 17 %[6]
Большое количество углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в грязи различных морских заливов и бухт.
Мюлкин - Филлипс и Стюарт изучали распределение углеводородокисляющих микроорганизмов в 35 – сантиметровом слое грунта и установили, что наибольшее количество этих организмов обнаруживается в самом глубоком слое; в верхней части 35 – сантиметровой колонки грунта их содержание составляло 10 клеток на 1 грамм. Авторы объяснили это тем, что углеводороды концентрируются в нижнем слое, а поверхностный перемешивается с водой.[5]
Из всего вышеизложенного можно сделать выводы, что углеводородокисляющие бактерии наиболее часто встречаются в местах непосредственного загрязнения нефтью: в почве и воде. Микроорганизмы – деструкторы нефти также можно встретить в донных осадках морей и различных водоемов, в грязи морских заливов и бухт. Углеводородокисляющая микрофлора в основном представлена бактериями, но довольно часто встречаются дрожжи и грибы.
Наибольшая численность микроорганизмов, окисляющих нефть обнаруживается в теплое время года, в холодное время они попадаются значительно реже.
Видовой состав микроорганизмов – нефтедеструкторов. Углеводородокисляющие микроорганизмы относятся ко многим таксономическим группам. В настоящее время известно около 100 видов бактерий и мицеллярных грибов, обладающих способностью усваивать углеводороды.[7]
Наиболее распространенным родом является р. Pseudomonas:род Pseudomonas является очень обширным; виды его обнаруживаются повсеместно: в воздухе, почве, пресной и соленой воде. Известно почти 200 видов, многие из которых подвижны, передвигаясь с помощью жгутиков. Некоторые вырабатывают зеленоватый флуоресцирующий пигмент, растворимый в воде. Образование пигментов характерно для видов: Ps. aeruginosa, Ps. boreopdis, Ps. oleovorans, Ps. fluorescens и другие. Присутствие пигмента нехарактерно для морских бактерий.
Большинство видов р. Pseudomonas вызывают брожение глюкозы, но не лактозы. Обычно они способны к восстановлению нитратов до нитритов, аммиака или азота.
Бактерии имеют вид палочек, единичных или парных, или даже коротких цепочек, размером в среднем от 0.5 до 2 мкм. Морфология колоний может быть различной.[7]
Представителями данного рода являются виды: Ps. sinuosa, Ps. boreopolis, Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. desmolyticum, Ps. radiobacter, Ps. liquefaciens и другие. [7,9]
Порядок Actinomycetales. Данный порядок характеризуется нитевидным строением клеток, хотя у микобактерий цепочки клеток или мицелий чаще всего либо являются рудиментарными, либо отсутствуют.[7]
Порядок Actinomycetales включает в себя такие семейства как сем. Mycobacteriaceae и сем. Actinomycetaceae.
р. Mycobacterium. Давно известно, что микобактерии способны усваивать углеводороды.[10]
Микобактерии содержат 30% липидов, неизменным компонентом которых являются миколовые кислоты, сосредоточенные в клеточной стенке. У сапрофитных микобактерий поглощение углеводородов происходит путем пассивной диффузии.[6]
Микобактерии часто бывают окрашенными – красно – оранжевые (группа rhodochrous) – выделены из вод Арктики. Они преобладают, в частности, в углеводородоокисляющей микрофлоре южного нефтеносного района.[11]
В молодом возрасте они имеют вид мелких, неподвижных палочек 2 – 3 мкм длиной и 0.4 – 0.6 мкм в поперечнике, часто соединенных попарно под углом. При старении клетки превращаются в очень короткие одиночные палочки.[10] Помимо палочек встречаются кокки, но реже.[12]
В основном микобактерии обладают слабой биохимической активностью: медленно разжижают желатин, либо вообще не разжижают, молоко не изменяют, практически не активны к сахарам, редко обладают инвертазной активностью и не восстанавливают нитраты.[10,11,12]
Типичные виды: M. album, M. luteum, M. rubrum, M. mucosum, M. convolum, M. lactiscola, M. paraffinicum, M. brevicale, M. phlei и другие.[7,10,11,12]
р. Nocardia (сем. Actinomycetaceae ) р. Proactinomycetes, p. Actinomyces и р. Micromonospora характеризуются разветвленным мицелием. Actinomyces и Nocardia являются потенциально патогенными для животных, тогда как Micromonospora редко бывают патогенными.
Наиболее характерными представителями р. Nocardia являются виды: N. actinomorphus, N. opacus, N. paraffinae, N. rubber, N. polychronogenes, N. agrestris и др.[7]
Род Bacillus: наиболее активные деструкторы. Рода Bacillus объединяет широкий ряд палочковидных аэробных и факультативно анаэробных эндоспорообразующих бактерий. Он включает термофильные и психрофильные, пресноводные и галофильные, ацидофильные и алкалофильные бактерии, способные гетеротрофно потреблять широкий ряд органических соединений или расти автотрофно.
Анализ последовательностей 16S РНК показал, что внутри рода содержится несколько филогенетически различных групп, часть которых уже выделена в новые роды: Alicyclobacillus, Paenibacillus, Halobacillus, Brevibacillus, Aneuribacillus, Virgibacillus. [13] Крахмал не гидролизуют, желатин не разжижают.[9]
Представители: Bac. hexacarbovorum, Bac. mesentericus, Bac. subtilis, Bac. circulans, Bac. brevis, Bac. palustris, Bac. sphaericus, Bac. mucoides, Bac. idosus и др.[5,7]
p. Desulfovibrio состоит из небольшой группы облигатных анаэробов, которые восстанавливают сульфаты до сульфидов. Они обнаруживаются в почве, соленой и пресной воде и морских илах. Обычно имеют вид изогнутых палочек или коротких цепочек, и в этом случае похожи на штопор.
В некоторых культурах наблюдаются необычно разбухшие клетки D. desulfuricans. Они передвигаются с помощью единичного полярного жгутика, хорошо развиваются в пресной воде и на начальной стадии выделения культуры не развиваются в морской воде, тогда как D. aestuarii предпочитает морскую воду или 3% минеральный раствор, обогащенный сульфатами и пептоном.
P. rubenshickii близок к обоим видам микроорганизмов, но он способен использовать масляную, пропановую, валерьяновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты, галактозу, сахарозу, лактозу и мальтозу.[7]
род. Methanomonas: считается состоящим из вида: Meth. methanica, широко распространенного в природе, вернее – в почве. Молодые клетки обычно представляют короткие палочки размером 0.5 – 0.8 мкм на 2.0 – 3.0 мкм и подвижны благодаря жгутику. Старые культуры могут иметь клетки почти крупные. Зонген выделил микроорганизм, который он очевидно считал принадлежащим к роду Pseudomonas, хотя относил их к Bac.methanicus. Орла – Джексон дал этому виду современное название Methanomonas methanica.
Метанобразующие бактерии являются облигатными аэробами, и поэтому неактивны в морских осадках и всюду, где глубина превышает несколько сантиметров.[7]
Помимо вышеуказанного вида, в природе встречается вид Methyiomonas sp., который осуществляет биодеградацию хлорированных углеводородов. Установлено, что смешанная культура метанокисляющих бактерий деградирует хлорированные углеводороды ( 3 – хлорэтилен, хлоралканы) в течение 2 – 4 суток.[14].
Род Rhodococcus. Постоянный компонент микрофлоры нефтяных залежей. Они используют газообразные н – алканы, включая их углерод в клеточную биомассу.[6]
В основном это аэробы, часто неподвижные, некислотоустойчивы.[15] Палочковидные (Rhodococcus erythropolis, пропаноокисляющие родококки); характерными свойствами представителей рода Rhodococcus является их плеоморфизм и 3х-стадийный жизненный цикл развития, включающий образование рудиментарного или хорошо развитого первичного мицелия, который фрагментируется на палочки и кокковидные клетки (микроцисты). Жизненный цикл кокки – палочки – кокки осуществляется обычно за 24 – 28 часов, реже за несколько суток [15].
Наиболее известные виды: Rhod. rhodochrous, Rhod. ruber, Rh. erythropolis, Rhod. luteus, Rhod. opacus, Rhod. maris, Rhod. terrae, Rhod. rubropertinctus, Rhod. equa, Rhod. chlorophenolicus.
Род Аrthrobacter: можно встретить в морях, в почве, пресных водохранилищах. Способны образовывать гликолипиды на н – алканах, усваивать антрацен, фенол. Не образуют миколовых кислот. В клетку углеводород поступает не через всю клеточную стенку, а через отдельные её участки. Выделяющееся из клетки вещество эмульгирует углеводород, а места его выхода служат каналами для поступления углеводородного субстрата в клетку[16].
Артробактерии являются одними из наиболее распространённых в почвах микроорганизмов, которые обеспечивают удивительную устойчивость к неблагоприятным факторам среды[16].
Типичными представителями – деструкторами данного рода являютяся: Arthrobaster sp., A. calcoaceticus, A. paraffineus, A. globiformis и др.
Род Aspergillus . Представителями этого рода являются наиболее изученными из углеводородусваивающих грибов. Аспергиллы характеризуются большой скоростью роста в самых разнообразных экологических условиях. Они обладают жизнеспособностью под действием ряда экстремальных факторов [7].
Образующиеся гифы проникают в среду с углеводородами, обильно ветвясь в ней. В гифах обнаруживаются жировые включения. Эти включения играют важную роль при усвоении углеводородов, эмульгируя их сложные фракции [17]. Аспергиллы были выделены из лесных почв, нефтяного ила, дизельного топлива [6].
Углеводородусваивающие аспергиллы: Aspergillus niger, A. fumigatus, A.sp, A. flavus, A. ochraceus, A. alliaceus, A. luchaensis и др. [7,18].
Род Candida: Для выращивания на парафинах в промышленных условиях рекомендованы штаммы C. guilliermondii и C. tropicalis.
Известно, что дрожжи C. guilliermondii Kangeron et Guerra являются гетероталличными гаплоидами, имеющими два типа спаривания, и при соответствующих условиях могут скрещиваться и давать диплоидное потомство. В связи с этим данный вид перенесён в род Pichia и классифицируется как Pichia guilliermondii Wickerham [19].
Таким образом, углеводородокисляющие микроорганизмы представлены вышеуказанными родами и видами, но следует заметить, что это далеко не все представители и роды данной группы организмов: кроме названных представителей в природе встречаются следующие роды бактерий: Rhodococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Achromobacter; дрожжей: Rhodotorula, Trichosporon и др. ; грибов Penicillum, Aspergillus [6].
Довольно перспективным в отношении очистки различных экосистем является род Rhodopsuedomonas, который встречается в основном в северных регионах. Типичные представители: Rh.capsulata, Rh. sphaeroides, Rh. palustris, Rh. rubrum и др. [20....