Дипломная работа: Клонирование гена atdreb1a arabidopsis thaliana

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4
1. Обзор литературы 5
1.1. Растения Arabidopsis thaliana 5
1.2. Преимущества растений Arabidopsis thaliana 5
1.3. Геном растений Arabidopsis thaliana 5
1.3.1. Секвенирование генома Arabidopsis thaliana 5
1.3.2. Индивидуальные гены, кодирующие белки 6
1.3.3. Гены арабидопсиса 7
1.3.4. Особенности генома арабидопсиса 7
1.4. Функции генов арабидопсиса 8
1.5. Таксономатика 9
1.6. Дополнительные сведения 9
1.7. Регуляторная роль транскрипционных факторов DREB в
устойчивости растений к стрессам окружающей среды 9
1.8. Влияние стрессов окружающей среды на растения……………….......10
1.9. Классификация растительных генов по функциям, которые выполняют продукты, кодируемые этими генами…………………………………..10
1.9.1. Продукты генов первой группы……………………………..........10
1.9.2. Продукты генов второй группы…………………………………..10
1.10.Характеристика гена rd29A……………...……………………………..11
1.11. Транскрипционные факторы DREB…………………………………..12
2. Материалы и методы 19
2.1. Материалы 19
2.1.1. Рстительный материал 19
2.1.2. Плазмиды 19
2.1.3. Праймеры…………………………………………………………...19
2.1.4. Модель «pl – GUS»………………………………………………...19
2.2. Методы 21
2.2.1. Выделение тотальной ДНК из растений Arabidopsis thaliana 21
2.2.2. Амплификация ДНК с помощью ПЦР 22
2.2.3. Элюция фрагментов??????????????????? 22
2.2.4. Клонирование………………………………………………………23
2.2.4.1. Рестрикция плазмиды «pl – GUS»………………………….23
2.2.4.2. Рестрикция наработанной ДНК…………………………….23
2.2.5. Лигирование…………………………………………...…………...23
2.2.6. Трансформация…………………………………………………….23
2.2.7. Транскрипция in vitro……………………………………………...12
2.2.8. Тест ПЦР……………………………………………………………12
2.2.9. Рестрикционный анализ…………………………………………...23
2.2.10. Трансляция in vitro………………………………………………..12
3. Результаты и обсуждение 25
3.1. Амплификация сегмента ДНК гена AtDREB1A 25
3.2. Элюция 25
3.3. Лигирование 26
3.4. Трансформация
3.5. Тест ПЦР
3.6. Рестрикционный анализ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 29
Приложения
Список использованной литературы 3

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Растения Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thsliana (рис.1) – горчица малая – мелкое растение из семейства крестоцветных (Brassicaceae), маленькое сорняковое растение, которое является «белой лабораторной мышью» для ученых (т.е. Arabidopsis – важная модельная система для определения генов и их функций). Это первое растение, геном которого был полностью секвенирован. Он содержит набор генов, необходимый для построения цветкового растения.



Рис.1. Внешнее изображение растений Arabidopsis thsliana
Ученые уверены, что они смогут использовать полученную информацию для улучшения плодового и пищевого качества хлебных злаков, а также для уменьшения вредного воздействия пестицидов и гербицидов.

1.2. Преимущества растений Arabidopsis thaliana
Основанием для выбора арабидопсиса послужили не только небольшие размеры его генома, но и мелкие размеры организма, что позволяет выращивать его в лабораторных условиях. Принимают также во внимание его короткий репродуктивный цикл, благодаря чему можно быстро проводить опыты по скрещиванию и отбору, детально изученную генетику, легкость осуществления манипуляций со сменой условий произрастания (изменение солевого состава почвы, добавление разных питательных веществ и т.д.) и с испытанием действия на растения различных мутагенных факторов и патогенов (вирусы, бактерии, грибы). Арабидопсис не имеет хозяйственной ценности, поэтому его геном, наряду с геномом мыши, получил название справочного, или, что менее точно, модельного.

1.3. Геном растений Arabidopsis thaliana
1.3.1. Секвенирование генома Arabidopsis thaliana
Интенсивная работа по секвенированию генома арабидопсиса была начата в 1996 г. международным консорциумом, в который вошли научные учреждения и исследовательские группы из США, Японии, Бельгии, Италии, Великобритании и Германии. В декабре 2000 г. стала доступной обширная информация, подводившая итоги определения первичной структуры генома арабидопсиса. Для секвенирования использовали иерархическую технологию: сначала изучали отдельные небольшие участки генома, из которых составляли более крупные участки (контиги), а на финальном этапе – структуру индивидуальных хромосом. Ядерная ДНК генома арабидопсиса распределена между пятью хромосомами. В 1999 г. были опубликованы результаты секвенирования двух хромосом, а появление в печати сведений о первичной структуре остальных трех завершило секвенирование всего генома. Из 125 млн. пар нуклеотидов определена первичная структура 119 млн., что составляет 92 % всего генома. Лишь 8% генома арабидопсиса, содержащих крупные блоки повторяющихся участков ДНК, оказались недоступными для изучения. По полноте и тщательности секвенирования геномов эукариот арабидопсис остается пока в тройке чемпионов наряду с одноклеточным дрожжевым организмом Saccharomyces cerevisiae и многоклеточным организмом животного Caenorhabditis elegance.

1.3.2. Индивидуальные гены, кодирующие белки
В геноме арабидопсиса обнаружено около 15 тыс. индивидуальных генов, кодирующих белки. Приблизительно 12 тыс. из них содержатся в виде двух копий на гаплоидный (единичный) геном, так что общее число генов составляет 27 тыс. Число генов у арабидопсиса не сильно отличается от числа генов у таких организмов, как человек и мышь, однако размеры его генома в 25-30 раз меньше. С этим обстоятельством связаны важные особенности в структуре отдельных генов арабидопсиса и общей структуры его генома.

1.3.3. Гены арабидопсиса
Гены арабидопсиса компактны, содержат лишь несколько экзонов (участков, кодирующих белки), разделенных короткими (около 250 п.н.) некодирующими отрезками ДНК (интронами). Промежутки между отдельными генами составляют в среднем 4.6 тыс. пар нуклеотидов. А гены человека содержат многие десятки и даже сотни экзонов и интронов, а межгенные участки имеют размеры от 10 тыс. пар нуклеотидов и более. Ученые считают, наличие небольшого компактного генома способствовало эволюционной устойчивости арабидопсиса, поскольку его ДНК в меньшей степени становилась мишенью для воздействия различных повреждающих агентов, в частности, для внедрения в геном вирусоподобных повторяющихся фрагментов ДНК (транспозонов).

1.3.4. Особенности генома арабидопсиса
Из других молекулярных особенностей генома арабидопсиса следует отметить обогащенность экзонов гуанином и цитозином (44% в экзонах и 32% в интронах) по сравнению с генами животных, а также присутствие дважды повторенных (дуплицированных) генов. Предполагают, что такое удвоение произошло в результате четырех одномоментных событий, заключавшихся в удвоении (повторении) части генов арабидопсиса, или слияния родственных геномов. Эти события, имевшие место 100-200 млн. лет назад, - проявление общей тенденции к полиплоидизации (кратному увеличению числа геномов в организме), характерной для геномов растений. Однако некоторые факты показывают, что у арабидопсиса удвоенные гены неидентичны и функционируют по-разному, что может быть связано с мутациями в их регуляторных участках.

1.4. Функции генов арабидопсиса
Что касается функции генов растений, то о них известно менее одной десятой того, что известно науке о генах человека. Даже у арабидопсиса, геном которого по степени изученности намного превосходит геном человека, функция почти половины его генов, общих с животными, имеется значительное число генов, специфичных только (или, по крайней мере, преимущественно) для них. Речь идет о генах, вовлеченных в транспорт воды и синтез клеточной стенки, отсутствующей у животных, о генах, обеспечивающих образование и функционирование хлоропластов, фотосинтез, фиксацию азота и синтез многочисленных ароматических продуктов. Этот перечень можно продолжить, но уже сейчас ясно, сколь сложная задача стоит перед функциональной геномикой растений (рис.2).




Рис.2. Классификация функций генов арабидопсиса
1 –гены роста, деления и синтеза ДНК; 2 – гены синтеза РНК (транскрипция); 3 – гены синтеза и модификации белков; 4 – гены развития, старения и смерти клеток; 5 – гены клеточного метаболизма энергетического обмена; 6 – гены межклеточного взаимодействия и передачи сигнала; 7 – гены обеспечения прочих клеточных процессов; 8 – гены с неизвестной функцией.

Полное секвенирование генома дает близкие к истинным сведения об общем количестве генов данного организма, позволяет поместить в банки данных более или менее подробные и достоверные сведения об их структуре, облегчает работу по выделению и изучению индивидуальных генов. Однако секвенирование генома отнюдь не означает установление функции всех генов. Один из наиболее перспективных подходов функциональной геномики базируется на выявлении работающих генов, на которых идет транскрипции (считывание) мРНК. Этот подход, в том числе испозьзующий современную технологию микрочипов, позволяет одновременно выявлять до десятков тысяч функционирующих генов. Недавно с помощью такого подхода начато изучение геномов растений. Для арабидопсиса удалось получить около 26 тыс. индивидуальных транскриптов, что резко облегчает возможность определения функции практически всех его генов. У картофеля удалось выявить около 20000 тыс. работающих генов, важных для понимания как процессов роста и формирования клубня, так и процессов заболевания картофеля. Предполагается, что это знание позволит повысить устойчивость одного из важнейших пищевых продуктов к возбудителям заболеваний.

1.5. Таксономатика
Систематическое положение арабидопсиса указано в талице 1:

Царство Растения Plantae
Подцарство Сосудистые растения Tracheobionta
Тип Покрытосемянные (Цветковые растения) Magnoliophyta
Класс Двудольные Magnoliopsida
Подкласс Дилленииды Dilleniidae
Порядок Каперсовые Capparales
Семейство Крестоцветные Brassicaceae
Род Арабидопсис Arabidopsis
Вид Арабидопсис Таля Arabidopsis thaliana


1.6 Дополнительные сведения
1. Русское название: Резуховидка Таля, Арабидопсис.
2. Геном был полностью секвенирован в 2000 году.
3. Размер генома составляет 114,5 Мb (в 61 раз меньше, чем размер генома человека.

1.7. Регуляторная роль транскрипционных факторов DREB в устойчивости растений к стрессам окружающей среды
Ген rd29А Arabidopsis thaliana кодирует гидрофильные белки, и экспрессия его вызвана стрессами засухи, холода и высокого содержания соли /1/. В области промотора гена rd29А имеются 2 DRE элемента, которые образуются при стрессах окружающей среды. Транскрипционные факторы DREB специфично связываются с DRE-элементами и контролируют экспрессию репортерного гена, который отвечает за устойчивость в засухе, холоду и высокому содержанию соли. Функция транскрипционных факторов DREB и DRE-элемента состоит в сигнальной трансдукции стрессов засухи, холода и высокого содержания соли. Один транскрипционный фактор DREB может контролировать экспрессию нескольких функционально-сложных генов в устойчивости к засухе, холоду и высокому содержанию соли. Таким образом, это может быть эффективно использовано для улучшения растений в сфере их устойчивости к стрессам путем переноса гена DREB /2/.

1.8. Влияние стрессов окружающей среды на растения
Стрессы окружающей среды, такие как засуха, холод и высокое содержание соли, являются причиной большой потери урожая. Хотя стрессы окружающей среды проявляются в различных формах, но все они имеют общее действие на водное состояние растений /3/. Засуха, холод и высокое содержание соли уменьшает содержание воды в клетках растений и таким образом повреждает всё растение целиком. При более неблагоприятных стрессовых условиях окружающей среды может происходить смерть растения /4/. Наземные растения растут в почве, и они не могут передвигаться самостоятельно, поэтому они очень чувствительны к неблагоприятным стрессовым условиям окружающей среды, и им необходимо приспосабливаться к этим условиям и избегать или уменьшать вред водного дефицита на клетку. Современные исследования сосредоточены на молекулярных ответах растения, когда оно находится в состоянии водного дефицита /5/.

1.9 Классификация растительных генов по функциям, которые выполняют продукты, кодируемые этими генами
Согласно последним данным, многие растительные гены вызваны засухой, холодом и высоким содержанием соли. Эти гены классифицируют на две группы, согласно функциям, которые выполняют продукты, кодируемые этими генами.

1.9.1. Продукты генов первой группы
Продукты генов первой группы включают функциональные белки, которые сразу защищают макромолекулы и мембраны (LEA-белки, осмотин, мРНК-связывающие белки); которые обеспечивают движение воды через мембрану (водно-канальные белки и мембранные переносчики); ферменты, которые катализируют биосинтезы различных осморегуляторов (пролин, бетаин и сахара). Устойчивость растений к засухе и высокому содержанию соли может быть улучшена путем переноса генов, которые кодируют LEA-белки, пролин-синтетазу или бетаин-синтетазу и т.д. Многие сообщения указывают на то, что продукты этих генов действительно выполняют определенную функцию в устойчивости к стрессам.

1.9.2. Продукты генов второй группы
Продукты генов второй группы включают транскрипционные факторы (bZIP, MYC, MYB и DREB); протеин-киназы (МАР-киназа и СDР-киназа, рецептор протеин-киназы, рибосомально-белковая киназа и транскрипционно-регуляторная белковая киназа и др.); протеиназы (фосфоэстераза и фосфолипаза С), которые включаются в сигналы трансдукции стрессов и в контроль экспрессии генов устойчивости к стрессам. Недавно двухкомпонентная система генов была обнаружена в Arabidopsis и табаке. Двухкомпонентный ген кодирует протеин-киназу, которая состоит из «сенсора» и «ответного регулятора» и вовлекает трансдукцию стресс-сигналов. Два из этих генов протеинкиназы- ATRR1 и ATRR2 Arabidopsis - вызваны засухой, холодом и высоким содержанием соли /6/. NTK1, двухкомпонентная система генов табака, вызвана высоким содержанием соли /7/.
До сих пор непонятен молекулярный механизм - как относятся клетки растений к водному дефициту, происходящему в результате засухи или холода; как эти стрессовые сигналы преобразовались в клеточные транскрипционные факторы; и как в дальнейшем контролировалась экспрессия функциональных генов. Таким образом, изучение экспрессии генов второй группы и функций кодируемых ими продуктов становится важным исследовательским элементом в молекулярной биологии растений. Здесь рассмотрен молекулярный механизм ответа растений на засуху, холод и высокое содержание соли и проанализирована контрольная роль транскрипционных факторов DREB в ответе растений на эти стрессы и, соответственно, экспрессия гена rd29А арабидопсиса /8/ и функция дегидратации ответного цис-элемента (DRE) /9/ и транскрипционных факторов DRE-связывающего белка (DREB) /10/.

1.10. Характеристика гена rd29А
Ген rd29А был первоначально изолирован из засухо-любивого растения Arabidopsis путём дифференциальной гибридизации скрининг-методом. Экспрессия гена rd29А вызвана при условиях засухи, холода и высокого содержания соли или при обработке экзогенной абсцизовой кислотой (АБК). Экспрессия гена rd29А отлична от другого гена rd (responsive to dehydration-ответ на дегидратацию) /11/. Были проанализированы их промоторы и определен DRE цис-элемент (TACCGACAT), вовлеченную в первую быструю экспрессию гена rd29А при стрессах засухи, холода и высокого содержания соли, а также проанализирован ABRE (АБК ответный элемент) цис-элемент, вовлеченный во вторую медленную экспрессию гена rd29А при этих стрессовых условиях. Ген rd29А может также быть вызван этими стрессами, когда ABRE-цис-элемент удаляется из области промотора /12/. Там, в промоторе rd29А, имеется 2 DRE цис-элемента. Известна центральная последовательность DRE-CCGAG. DRE –цис-элемент или его центральная последовательность была найдена в генах Arabidopsis rd17, kin1 и cor6.6, которые также вызваны стрессами засухи, холода и высокого содержания соли /13/. Подобная модель (С-повтор, TGGCCGAC) была найдена в области промотора гена cor15а в Arabidopsis thaliana, вызванного холодом /14/. Центральная последовательность CCGAC также была найдена в промоторе вызванного холодом гена BN115 в Brassia rapus , выраженная элементом, отвечающим на низкую температуру (LTRE) /15/. Эти данные говорят о том, что DRE цис-элемент (или его центральная последовательность) – это широко распространенные в растениях гены, вызванные стрессами засухи, холода и высокого содержания соли.....