Курсовая работа: Виды культур клеток

Содержание

Введение...............................................................................................................................3
1. Виды культур клеток........................................................................................................4
2. Получение клеточных культур...............................................................................…5-13
3.1. Приготовление первичных клеточных культур………………………................…5
3.2. Получение монослойных перевиваемых культур клеток......................................5
3.3. Роллерное культивирование клеток......................................................................8
3.4. Суспензионное культивирование клеток...............................................................10
3.5. Культивирование клеток на микроносителях……………………………………..13
4. Выращивание вирусов в культурах клеток..............................................................16-20
4.1. Предосторожности при работе с зараженными вирусами клетками....................16
4.2. Обнаружение вирусов.............................................................................................17
Список литературы.............................................................................................................21
ВВЕДЕНИЕ
Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искус¬ственных условиях и положили начало глубоким науч¬ным исследованиям тканевых культур.
Большая заслуга в деле paзработки методов куль¬тивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток жи¬вотных в искусственных условиях и тем самым проде¬монстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа иссле¬дователей под руководством Эрла. Они первые получи¬ли рост большого числа клеток на стекле и в жидкой пе¬ремешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и ус¬пехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.
Тканевые культуры давно нашли применение для ре¬шения различных вопросов биологии и медицины. Од¬нако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стиму¬лом их развития до современного уровня.
Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.
1. ВИДЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК.
Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочис¬ленных структурных элементов ткани или органа, в состав ко¬торых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под конт¬роля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особен¬ностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.
Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и гене¬тических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тка¬ней in vivo.
В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов пе¬реживающих и растущих культур тканей и клеток. Наиболь¬шее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологиче¬ской практики.
Различают два основных вида однослойных клеточных куль¬тур: первичные и перевиваемые.
Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, по¬лученную непосредственно из тканей че¬ловека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифиче¬ской дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Перио¬дическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни пер¬вичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.
Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут со¬хранить способность к росту и размножению. Эти клетки, об¬наружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.
Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевивае¬мые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и дру¬гих клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.
Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по срав¬нению с любой первичной культурой, состоит в потенции неог¬раниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.
Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобре¬тают способность к автономному существованию, подобно мик¬роорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.
Усовершенствование техники культивирования клеток зна¬чительно расширило возможности получения перевиваемых кле¬точных линий из самых разнообразных тканей животных и че¬ловека. При этом не был обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неог¬раниченному росту in vitro, т.е. к трансформации.
Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформа¬ция клеток происходит in vivo в результате развития патологи¬ческого процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной.
Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С тру¬дом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскокле¬точного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравни¬тельно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачест¬венных опухолей нервной системы.
Особую категорию клеточных культур составляют полупере¬виваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток.
3. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.
3.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.
Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращивае¬мая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первич¬ная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, по¬скольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro. В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.
На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или фер¬ментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 - 3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибио¬тиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищен¬ная) и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток.
Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагмен¬тов. Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, миг¬рирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты.
Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.
3.2. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК.
Как уже отмечалось выше, одним из методов получения перевиваемых клеточных ли-ний является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным моно¬слоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по не¬большим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязне¬ние) и хранят при t - 4°.
Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в не¬делю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосред¬ственно перед работой подогревают до t - 37°.
По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездча¬тый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появ¬ляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию.
В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре моно¬слоя или между стянутыми его участками появляются округ¬ленные клеточные элементы, из которых постепенно формиру¬ются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напомина¬ющие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтому обязательным условием при смене питательной среды является поддержание ее постоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются крупные полигональные клетки с длинными отростками.
Возникшие в процессе отбора атипичные клеточные эле¬менты должны быть отделены от остальных участков монослоя и перенесены в отдельные пробирки или матрасы. Для этого может быть использован метод версенизации или механиче¬ский откол атипичных клеток с помощью бактериологической петли или шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с культурой клеток почек обезьяны, где колонии атипич¬ных клеток плотно прикреплены к стеклу и сами от него не от¬деляются.
При смене питательной среды в случае появления атипичных клеток рекомендуется осторожно удалить большую часть рос¬товой среды, а меньшей частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить по пробиркам. В этом случае в среде могут.....