Курстық жұмыс: Биология | Өсімдік пероксидаза ферментіне сипаттама

Мазмұны

КІРІСПЕ 3
1.1. Өсімдік пероксидаза ферментіне сипаттама 4
1.2. Пероксидазаның қызметі, изоформалары мен субстраттары 5
1.3. Пероксидазаның қорғаныш қасиеті 7
1.4. Өсімдіктер патогенмен залалданғандағы пероксидазаның
маңызы 9
1.5. Fusarium туысына сипаттама 10
2.1. Зерттеу объектілері 12
2.2. Зерттеу әдістері 12
2.2.1. Суспензияны алу және өсіру 12
2.2.2. Fusarium solani саңырауқұлағын өсіру 12
2.2.3. Өсімдікті саңырауқұлақпен залалдау 13
2.2.4. Пероксидазаның активтілігін анықтау 14
3. ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ
3.1. Fusarium solani саңырауқұлағының өсу циклі 15
3.2. Пероксидазаға саңырауқұлақ мицелилерінің әсері 15
ҚОРЫТЫНДЫ 17
ПАЙДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 18

1.1. Өсімдік пероксидаза ферментіне сипаттама
Пероксидаза – екі компонентті фермент. Бірінші компоненті - активті топ, субстраттармен химиялық байланысқа түсетін бөлігі. Екінші бөлігі - коллоидты белокты « тасымалдаушы», осы топтың каталитикалық әсерін күшейтуші. Глобулярлы белок, диаметрі 50 Аº. Пероксидаза акцептор ретінде судың асқын тотығына әсер ететін фермент. Пероксидаза боялмаған гликопротеинді және қоңыр - қызыл феррипорфириннен тұрады.
Пероксидаза ферментінің құрылысы.
Протогемотин IX - активті орталық және судың асқын тотығының ыдырауында немесе активтенуінде негізгі рөль атқарады. Ферропротонфирин IX активті орталық құрамына кіреді және гемнің порфириндік сақинасын құрайды.
Осы парфиринді макроцикл мен белок гидрофобты әсерлесіп, нативті пероксидазаның үшінші кеңістік құрылымын құрайды. Протопорфирин гемі бар ферменттердің белоктық глобуласына маңызды тұрақтандырғыш әсер береді. Ферменттің простетикалық тобын алып тастаса пероксидазалық активтілігі жоғалады, бірақ оксидазалық қасиетті тұрақты болып қалады.
Ферменттің бірінші реттік құрылымын зерттеу желкен пероксидазасынан басталады. 1970 ж Шэннон әріптестермен /2/. Желкен тамырынан алынған пероксидазаны бес бөлік фракцияға бөлді: А1, А2, А3 В және С. Әріптестер осы пероксидазаның белоктың бөлігі 18 амин қышқылдан тұратындығын анықтады. А1, А2, А3 пероксидазалардың құрамында оксипролині бар, ал В және С - да жоқ. А - пероксидазаларда В мен С-ға қарағанда ароматтық амин қышқылдар көп болады. Әр бір пероксидаза бір полипептидтік тізбектен тұрады. Бейтарап және аминоқанттар пероксидазаның молекуласының көмірсутектік бөлігі 20% тен көп болады. Соның ішінде глюкоза, галактоза, манноза, арабиноза, фруктоза және гексозамин. Сонымен қатар айтып кету қажет, кейбір пероксидазалар изоэнзимдерінде көмірсутектік компоненттер болмауы мүмкін. Мысалы темекінің W-38 А1 және А2 изоэнзимдерінде жоқ екенін анықтайды /2/.
Пероксидаза молекуласындағы көмірсутектік компоненттердің маңыздылығы соңына дейін анықталған жоқ. Авторлар болжамы боцынша, көмірсутектер ферменттің мембрана арқылы өтуін жеңілдетеді және 3 реттік құрылымды тұрақтандырады
Өсімдіктердің жануарлардан ерекшелігі, жағымсыз әсер жерінен кете алмайды, олар оған бейімделуі қажет. Бос ИСҚ болуы өсу факторы болып саналады, сонымен қатар ИСҚ декарбоксильденуі ПО байланысты болғандықтан, өсімдіктің өсуі ПО қатысуымен жүрнді. Жоғарғыдағы пероксидазаның биохимиялық рөлін қарастыра отырып, өсуді бақылаудың екі кезеңді механизмін айқындауға болады – ИСҚ бақылау (сілтілік пероксидазалар) және клетка қабығын қатайтатын лигнин түзуші қышқыл пероксидаза. Екінші топ изопероксидазалар этилен биосинтезі арқылы байланықан. Сонымен қатар плазмалық мембрананың редокс – жүйесіне қатысуы өсу процесіне әсер береді.
Өсімдік ұлпаларының вирустар, бактериялар, саңырауқұлақтармен залалдануы пероксидазаның индукциясына әкеледі. Бұл пероксидазалық жауап қорғаныш механизмінің бір бөлігі және де бұл барлық өсімдіктерге тән. Кейбір жағдайларда (спецификалық) арнайы изопероксидазаларды анықтауға болады. Мысалы картоптың ісігінің пайда болу кезінде қышқыл пероксидазалардың түзілуі көрінген. Пероксидаза синтезінің индукциясы транскрипция сонымен қатар трансляциямен бақылануы мүмкін. Қайта синтезделетін изопероксидазалардыңфункциясы, клетка қабығының матрицасының компазмициясының өзгеруі болып келеді, ал ол өз кезегінде клетка қабығының сыртқы әсерлерден қорғауын қамтамасыз етеді. Пероксидазаның функциональды активтенуі үшін судың асқын тотығы мөлшері болып келеді. Негізінен элиситорлардың әсері сутектің асқын тотығының тез түзілуімен көрінеді. Патогеннен қорғанудың бір варианты – оған токсикалық фенолды қосылыстардың түзілуі және зақымдалудың локализациялануы.
Химиялық табиғаты бар стрестік факторларға пероксидаза жауап береді. Оны тұздың жоғарғы концентрациясы, никель мен қорғаныс иондары индукциялайды. Сонымен қатар, озонның өсімдік пероксидазасының активтілігіне тежегіштік әсер етеді. Тажа жапырақтағы пероксидаза сульфиттен сулфатқа дейін тотығуын қомтамасыз етеді, бұл пероксидазаның қорғаныс функциясыныңқышқыл жаңбырлардың әсерін детоксикалауында көрінеді. Ферменттің биохимиялық және физикалық функцияларын қорытып мына схемадан көруге болады.


1.2. Пероксидазаның қызметі, изоформалары мен субстраттары.
Пероксидазаның негізгі функциясы – химиялық қосылыстардың тотығуын Н2О2 көмегімен катализдеу. Бұл процес кезіндегі аралық комплекстер тұзіледі. 1 комплекс Н2О2 қосылғанда түзіледі де, ол тез арада 2-ші комплекске айнелады. 3-ші және 4-ші комплекстер Н2О2 аралық мөлшерде түзіледі.
E + S1→k1←k2 E1 + H2O (1)
E1+ S2→k2 E2 + P (2)
E2+ S2→k3 E + P (3)
2P→k4P (4)
мұнда,
Е - нативті фермент, Е1 және Е2- 1 және 2 комплекстердің аралық қосылыстары,
S2 және S1 – судың асқын тотығы және оның доноры,
К – реакция жылдамдығының константасы,
P – реакция өнімі.
Фромма /2/ зерттеуі бойынша, пероксидазаның әсер ету механизмі үш субстратқа арналған реакция екенін көрсетті. Бұл жерде фенолдар екі тәуелсіз субстрат, ал асқын тотық үшінші субстрат. Осы реакцияда бос радикал пайда болады. Олар екі әр түрлі каталіздік реацияларда пайда болуы мүмкін және олар димерлерге бірігеді.
Чанс және Фредович бойынша, пероксидаза субстраттарын екі топқа бөлуге болады. Бірінші топтың субстраттары геммен байланысады, оған бейорганикалық иондар (ферроцианид, йодид, нитрид және т.б.) жатады. Екінші топ субстраттар геммен әрекеттеспейді. Оларға ароматты аминдер және фенолдар жатады. Субстраттар әр түрлігі рН мағынасының әр түрлігінде көрінеді /19/.
Пероксидазадағы жалғыз темір ионы судың асқын тотығын активтендіре қоймай, оған тотығу реакциясына қатысуына хабаршы болады. Пероксидаза каталитикалық әсері кезінде активті оттегі көзі ретінде органикалық қосылыстармен тотықтырада, соның ішінде қанықпаған май қышқылдарының тотығы және каротиндер де болуы мүмкін. Сонымен қатар ферменттің пероксидазалық қасиеті ғана емес, оның оксидазалық қасиетіде белгілі болды. Оксидазалық қасиеті бойынша фермент активті емес О2 молекуласының көмегімен біртек қосылыстарды тотықтырады.
Оксидазалық функциясының ашылуы Теорелл үлесіне тиеді. Ол кейбір өсімдіктерде тотықтыратын дигидроксифуморлы қышқылын (ДГФ) тауып, пероксидаза екенін дәлелдеп береді. Ферменттің оксидазалық функциясы әр түрлі химиялық тегі бар заттармен әсерлескенде көрінеді. Мысалы: фиороглиецин, дигидроксифумарат, гидро- және нафтогидрохинон, глютатион т.б. Оксидазалық реакцияның керекті шарты – марганец кофактор – иондары мен әр түрлі фенолдық қосылыстардың болуы. Оксидазалық функцияның пайда болуы мына субстраттарға байланысты: гидро - нафтохинондар, индолил сірке қышқылы (ИСҚ) т.б.
Қорыта айтқанда, пероксидаза әр түрлі ферменттік активтілік көрсеткендіктен, оны реттеуіш ферменттер қатарына жатқызуға болады . Сонымен қатар ол өзінің спецификалық функцияналдық топтарын коваленттік немесе иондық модификациялау арқылы активтілігін өзгерте алады. Ферменттің физиологиялық функциясының эффективті атқаруын қамтамасыз ететін факторлар: активті орталығының динамикалық құрлысы, активті орталығының жартылай функционалдылығы, пероксидазадағы жоғарғы потенциалды электрон транспортының бірнеше жолының болуы. Пероксидаза активтілігін рН ингибиторлары және активаторлары арқылы реттеу ферменттің субстратқа деген спецификалық қасиетін шектеп, көптеген болатын реакциялардың ішінен біреуінің ғана өтуіне мүмкіндік береді.
Изофермент деген ұғым пероксидазамен байанысты. Пероксидаза бір полипептид тізбегінен тұрады және жоғарғы деңгейлі молекулалық гетерогендік қасиетке ие болады. Олардың изоензимдік жиынтығы қышқылдық, бейтараптық және сілтілік түрлерден тұрады. Желкеннің пероксидазасын зерттеу кезінде анықталды. Осы ферменттің әр түрлі изоформаларының болуы белгілі амин қышқыл қалдықтарының гликолизденуіне байланысты екені.
Сонымен қатар анықталды, бөлек изопероксидазалар in vitro жағдайында әр түрлі функция атқарады, бірақ in vitro жағдайында субстраттарға ерекшелік қасиеттерінің жабу қасиетін көрсетеді. Олар өзара әсері бойынша байланысты, ал гендік құрамы бойынша әр түрлі болып келеді.
Пероксидаза субстраттары. Пероксидаза табиғаты әр түрлі субстраттарға өте кең сәйкестігінің болуы оған деген қызығушылық туғызады. Фермент және субстрат әрекеттесу реакциясына түсу үшін екі құрлымдық ерекшелікке ие болу керек.
1) ерекше химиялық байланыс, бұл ферменттің шабуыл жасау үшін
2) функционалдық топтың болуы, бұл субстраттың молекуласының активті орталықта ферменттің каталитикалық орталығына қарағанда дұрыс орналасуы үшін қажет.
Фермент – субстрат қосылысының пайда болу реациясының жылдамдығы өте үлкен және ферменттің активтілігі осы комплекстің ыдырау жылдамдығымен өлшенеді немесе Михаэлс – Ментон Кm константасымен өлшенеді. Бірақта Кm мағынасы реакцияны қандай изоэнзим катализдейді екеніне байланысты өзгеріп отырады. Соған байланысты Пенсон мен Ли пероксидазаның екі изоэнзимін жасанды (о – дианизидин және бензидин ) және табиғи ( эцгенол, кофейн және ферул қышқылдары ) субстраттары арқылы бөліп алды. Сол арқылы көрсеткендей, Кm мағынасы әр түрлі болады, қолданылған қай субстратты пайдалануына байланысты.
Кm мағынасы субстратқа қоспа реакциясының рН мөлшеріне және температураға байланысты. Егер фермент жақын субстраттардың өзгеруін катализдесе, онда әр бір субстратқа сәйкес өзіндік Кm мағынасы болады.
Сонымен қатар, филогенетикасы әртүрлі бар өсімдіктер бензидин, гваякол және пирогаллол субстраттарына тәуелділігіне байланысты бөлінеді. Ферментке жақын бояғыш субстраттар (бензидин және оның туындылары о – дианизидин және гваякол) басқа субстраттарға қарағанда изоэнзимдерді айқындауда көп қолданады.
Сонымен, пероксидаза гемі бар гликопротеид. Оның каталитикалық қасиеті Н2О2 –ға қатал сәйкес, бірақ ол субстратқа байланысты кең сәйкестік көрсетеді. Көптеген ғалымдар пероксидазаның бір активті орталығы бар деп есептейді және оның құрамына 3 валентті және валенттігін өзгертпейтін темір атомы кіреді.

1.3. Пероксидазаның қорғаныш қасиеті
Жануарлар организмінде патогендерден қорғану механизмі өте күрделі болып келеді. Бұл механизмнің негізі қорғаныш белоктардың түзілуінде. Өсімдіктерде де сондай – ақ антиденелер сияқты белоктар синтезделеді. Олар антиген –антидене принципі бойынша жұмыс атқарады. Олардың арасында сутектік және гидрофобты байланыстар түзіледі. Ондай байланыстар бір молекула ішіндегі пептидті тізбектің иондалған бөліктер арасында, әр түрлі молекулалар арасында, сонымен қатар макромолекулалар мен төменгі молекулалы органикалық және бейорганикалық иондар арасында түзілуі мүмкін. Осы соғы байланысты реакцияға қабілеті бар COOH, NH2 және SH тобы бар пероксидаза ферменті атқара алады.
Антидене ретінде әр түрлі қосылыстар болуы мүмкін, соған байланысты пероксидаза өзінің субстраттары (фенолдар, аминоқосылыстар) және судың асқын тотығы қатысуы арқылы тотығу – тотықсыздану актін жүргізе алады, қорытындысында клеткадағы қажет емес қосылыстар жойылады (утилизация). Пероксидаза патогендердің белоктарымен келесі сызба арқылы әсерлесе алады:
Пероксидазаның патогендермен әсерлесуі.

2H+ + H2O2 2I- Белок – S
Пероксидаза Белок – SI
2H2O 2I+ Белок – SH
3 сурет.
Осы реакция арқылы пероксидаза + оның субстраты + Н2О2 организмнің қорғаныштық реациясына қатысады деп санайды. Функционалдық топтардың болуы және гликопротеидтік табиғаты пероксидаза ферментіне әр түрлі қосылыстармен ковалентті байланысуына жол ашады, ал галогендер мен Н2О2 болу кезінде антибактериоциттік комплекс құрайды.
ПО – сыртқы әсерлерге өте сезімтал келетін фермент. Функциясы жағынан ол өте лабильді, гоместаздың әртүрлі бүлінуіне әсер береді.
Стрестік фактор ретінде абиотикалық (төменгі және жоғарғы температура, сусыздану, осмас қысымы, тұздардың жоғарғы концентрациясы, токсикалық газдар) сонымен қатар биотикалық (вирустар, саңырауқұлақтар және бактериялық аурулар). Жағымсыз әсерлер аз уақытта (бірнеше минуттан сағаттарға дейін) және ұзақ (күндер, апталар) уақытқа дейін созылады. Сол кезде ПО белгілі изоформаларының активтенуінен ортақ активтенуі тіркеледі, белгілі бір изоформалардың активтенуі сонымен қатар ферменттің молекуласының конфармациясының өзгеруі көрінеді. Сонымен қатар ферменттің синтезделу жылдамдығының өзгеруі мүмкін, бір клеткалар жиынынан ферменттің екіншіге өтуі мүмкін. Клетка культурасының ПО комплексіне стрес – факторлардың әсерін зерттеуге арналған жұмыстар өте аз. Ғалымдардың айтуы бойынша тұздың жоғарғы концентрациясында ферменттің активтілігінің жоғарлауы клеткадағы бір немесе екі валентті иондардың әсерінен пероксидазаның әртүрлі компартментациясының қайта құрылуы болып саналады. Сол себепті клетка культурасына патогенез факторының әсері ПО комплексінің өзгеруін бақылайтын модельді құрлым. Қайын суспензия културасының клеткасыртылық пероксидазаның активтілігіне тот саңырауқұлағының мицелилерінің, хитозанның және хитиннің әртүрлі әсерлері зерттелген.Хитин және ммицелилер контрольмен салыстырғанда ПО активтілігін төмендетеді, бірақ клеткалардың тіршілік қабілетін жоймайды. Хитозаның 150 мкг/мл концентрациясы ПО активтілігін төмендетті, ал 300 мкг/мг концентрациясында 72 сағат әсер еткенде ферменттің активтілігінің 5 есе өсуі көрінеді және бұл жағдайда клеткалар өледі. Бұндай ұлғаю клеткалардың дегредациясы кезіндегі ПО секрециясынан пайда болуы мүмкін ал ол өз кезегінде ортадағы субстрат мөлшерінің көбеюімен байланысты. Пероксидазаның активтілігінің жоғарлауын ағзаның қорғаныштық функциясы ретінде қарастыруға болада./13/
1.4. Өсімдіктер патогенмен залалданғандағы пероксидазаның маңызы
Көптеген зерттеушілер патогенез кезінде соның ішінде саңырауқұлақтардың әсері кезінде пероксидаза активтілігі көтерілуін көрсетті. Көптеген өсімдіктерде саңырауқұлақтардың патогендеріне тұрақтылығы пероксидазаның активтілігінің көтерілуіне тура пропорционалды. Белгілі, залалданған кезде клетка мембранасымен байланысқан пероксидаза активтілігі көтеріледі, айтсақ, осы саңырауқұлақтардың кіретін жеріндегі ферменттердің активтілігі жоғарлайды. Бұл пероксидазаны өзіне тартатын саңырауқұлақтың клеткасының сыртындағы векторларының болуын көрсетеді.
Пероксидаза – полифункционалды фермент, көптеген және әр түрлі функционалды изоформалармен ерекшелінеді. Саңырауқұлақтар залалданғанда ферменттің активтенуі de novo синтезделуінен немесе бар иноформалардың көмегімен активтенуі мүмкін. Кейбір авторлардың айтуы бойынша стрест жағдайларда, соның ішінде патогендер енуінде, ферменттің сілтілік изоформалары бірінші болып активтенеді. Кейбір жағдайда өсімдіктердің саңырауқұлақтарға қарсы тұруы алдымен пероксидазаға байланысты. Белгілі, клетка қабығымен байланысқан анионды пероксидаза лигнин түзу процесіне активті қатысады, ал лигнин өсімдіктің патогендердің енуіне қарсы қорғаныс болып келеді. Инфекция кезіндегі басқа бір кедергі ол суберин. Оның синтезіне пероксидазаның қышқылдық изоформалары қатысады.
Саңырауқұлақтық патогенез кезіндегі пероксидаза активтілігін әр түрлі жолмен басқаруға болады. Ол біріншіден гормондық басқару. Өсімдік гормондарының балансының өзгеруі пероксидазаның активтенуіне немесе тежелуіне әсер етеді. Белгілі ИСҚ және АБК өсімдіктердің физиологиялық процестеріні реттелуі антигонисі ретінде қаралады және өсімдіктер клеткаларындағы пероксидаза изоформаларының активтілігінің гормондық бақылыуының механизмі ретінде көптеген ғалымдардың қызығушылығын тудырады.
Көрсетілген картоп түйіндеріндегі аниондық пероксидазаның активтілігі АБК -мен басқарылады. Салицил қышқылы жақсы зерттелген иммуномодулятор. Өлі клетканың сыртындағы пероксидазаның индукторы ретінде қызмет атқара алады.
Пероксидаза активтенуі сигнал жүйесінде негізгі болып келеді. Ол элиситорлық белгі болып және қорғаныш геннің экспресиясын, PR-белоктың, протеаза ингибиторларының, О2 активті түрін туғызады.

1.5. Fusarium туысына сипаттама
Fusarium туысындағы саңырауқұлақтар табиғатына кең таралған және олардың көбі сапрофитті болып келеді. Бірақ кейбір жағдайда олар паразитті болуы мүмкін. Олар көбіне ауыл шаруашылық өсімдіктерін зақымдайды /1/.
Топырақ Fusarium туысына жататын түрлердің табиғи таралған ортасы болып саналады (1). Топырақта Fusarium активті формада болады, өсімдіктің әр түрлі қалдықтарында, ризосферада және тамырдың үстіңгі жағында өседі. Бұл түрге жататын саңырауқұлақтар ішінде ризосфералық және тамырмекенділер көп кездеседі. Өсімдіксіз топырақта олардың саны өте аз, себебі олар басқа саңырауқұлақтар және бактериялардың бөлген антибиотиктері мен литикалық ферменттеріне өте сезімтал келеді.
Олар қоректік орта, яғни көмірсутектің көп мөлшері бар жерде жақсы өседі. Бұл саңырауқұлақтар факультативті анаэробты болып келеді. Көптеген .....