Дипломдық жұмыс: Биология | Алма гермоплазмасының криогенді коллекциясын жасау

Мазмұны

КІРІСПЕ 3
1. НЕГІЗГІ БӨЛІМ 4-29
1.1 Әдебиетке шолу 4-18
1.1.1 Криобиологияның дамуы 4-5
1.1.2 Өсімдік материалын криосақтаудың ерекшеліктері 5-6
1.1.3 Өсімдік клеткаларының төмен температураларға бейімделу жолдары
6-8
1.1.4 Криосақтаудың негізгі сатылары 8-14
1.1.5 Сұйық азотта сақтау 14
1.1.6 Еріту, криопротектордан тазарту және өсімдіктердің регенерациясы 14
1.1.7 Криосақталған гермоплазманы бағалау әдістері 15
1.1.8 Алма гермоплазмасын криосақтау 15-16
1.1.9 Генетикалық ресурстарды сақтау үшін криоcақтау әдістерін пайдалану
17-18
1.2. Материалдар мен әдістер 19-23
1.2.1 In vitro жағдайына енгізу 19
1.2.2 Эксланттарды Viss ортаға тексеру 19-20
1.2.3 In vitro өсімдіктерді микроклональды көбейту 20
1.2.4 Апикальды меристемаларды бөліп алу 20
1.2.5 Апикальды меристемаларды криосақтау 20-23
1.3 Нәтижелер мен оларды талқылау 24-29
1.3.1 Aлманың апикальды меристемарын бөліп алу әдісін жетілдіру
24
1.3.2 Алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы
25
1.3.3 Алма гермоплазмасының коллекциясын жасау 25-29
ҚОРЫТЫНДЫ 30
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 31-33
Жемісті культураларды генетикалық жақсартудың негізгі шарттарының бірі – шаруашылыққа құнды белгілерге ие өсімдіктердің жабайы формалары мен мәдени түрлерінің генофондын сақтау болып табылады. Қазіргі кезде өсімдіктердің генетикалық материалын сақтаудың бірнеше тәсілі бар. Бәрінен бұрын, бұл далалық гендер банкі мен помологиялық коллекциялар.
Әлемдік практикада генетикалық материалды сақтаудың дәстүрлі формаларын толықтыру ретінде баяу жүретін метаболизмді қамтамасыз ететін, гермоплазма үлгілерін in vitro криоконсервациялаудың биоинженерлі әдістері кең қолданылады.
Криоконсервацияның артықшылықтары: егу аудандарын үнемдеу, вирустар мен патогенді микроорганизмдерден таза өсімдік алу, көбею коэффициентін мың есе арттыру, сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан өсімдіктердің сорттары мен формаларының генофондын ұзақ уақыт сақтау мүмкіндігі [1].
Криосақтау – бұл өсімдік ұлпаларын, мүшелерін және клеткаларын терең мұздату және өте төмен температурада сақтау әдісі (-1960C). Бұл обьектілердің генетикалық сипаттамаларын кез келген мерзімде сақталуына мүмкіндік береді. Бұл әдіс арқылы әр түрлі материалдарды, бөліп алынған протопласттардан бастап ұрық пен тұқымдарға дейін сақтауға болады [2].
Жұмыстың мақсаты алманың селекциялық құнды сорттары мен формаларының криогенді коллекциясын жасау және алма гермоплазмасын сұйық азотта сақтау ұзақтығының әсерін анықтау болып табылады.
Міндеттері:
- пробиркалық өсімдіктердің апикальды меристемаларын бөліп алу және культивирлеудің әдістемелерін жетілдіру;
- алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы;
- алма гермоплазмасының коллекциясын жасау.

1. НЕГІЗГІ БӨЛІМ

1.1 Әдебиетке шолу

1.1.1 Криобиологияның дамуы

Өсірілетін материалды сақтаудың ең тиімді және сенімді әдістері криогенді әдістер болып табылады. Температура өте қатты төмендегенде, яғни материал мұздағанда, зат алмасу толық тоқтап, сақтау кезінде молекулаларда айтарлықтай физико-химиялық өзгерістер болмайды [1,2].
Өсімдік клеткаларын сақтаудың криогенді әдістері өткен ғасырдың алпысыншы жылдарында жасала бастады, алайда 1905 жылы-ақ сұйық азотта тұқымдар мұздатылған. Өсімдіктердің суыққа төзімділігін зерттеуді 1908 жылы академик Н.А.Максимов бастаған [3].
Клеткалық және ұлпа культураларын ең алғаш 30 жыл бұрын мұздата бастады. Бұл жұмыстарды И.И.Туманов, Р.Г.Бутенко мен И.В.Оголевец жемісті дақылдардың каллустарымен жүргізді [4]. Каллустарды сұйық азот температурасына дейін мұздату мүмкіндігін А.Сакаи мен И.Сугавара терек ұлпасында, М.Такучи маршанция ұлпасында көрсетті [5]. Бұл жұмыстарда каллустарды алдын-ала шынықтырып, қант мөлшері көп орталарда өсірді. Суспензиялы культураларды зерттеуді Кватран зығыр клеткаларынан бастап, Латто, И.Сугавара, А.Сакаи мен Б.Финкль сәбіз, темекі, т.б.өсімдіктермен жалғастырды [3]. Б.Финкль мен Дж.Ульрих криопротекторлардың әр түрлі қатынасын пайдаланып, қант қамысының суспензиялы және каллус клеткалары культурасын сәтті мұздатуға қол жеткізді [6].
Қазіргі кезде әр түрлі жеміс-жидекті дақылдардың меристемаларын криоконсервациялау әдістерін жетілдіру жұмыстары жүргізілуде. АҚШ-та криоконсервация бұрыннан бері жеміс-жидекті дақылдар мен жүзімнің генетикалық материалын сақтаудағы негізгі әдіс болып табылады. АҚШ-та өсімдіктер гермоплазмасын сақтаудың Ұлттық жүйесі құрылған. Мұнда 1983 жылдан бері суықта сақтау, ал 1987 жылдан бері криосақтау әдістері қолданылады.
Қазақстанда криосақтау бағытындағы жұмыстар 2002 жылдан бастап Ұлттық Ғылым Академиясының академигі, профессор И.Р.Рахимбаевтың жетекшілігімен Өсімдіктер физиологиясы, генетикасы және биоинженериясы институтында жүргізіле бастады [7,8].
Ресейдің Қиыр Шығысының 5 регионында өсетін өсімдіктердің 33 тұқымдасының 103 түрінің тұқымдарының криотөзімділігі зерттелген. Зерттелген түрлердің тұқымдарының 89,1%-ның криосақтау процесінде тіршілік қабілеті төмендемегені анықталды. Тұқымдардың төмен температураға жауап реакциясының популяция аралық өзгергіштігі алты түр үшін анықталды. Терең анабиозды тудыратын сұйық азотта тұқымдарды мұздату – оларды ұзақ уақыт сақтау режимі ретінде қолданылуы мүмкін. Генетикалық әртүрлілікті популяция деңгейінде алдын-ала бағалау түр генофондының мобилизациясын жүргізуге мүмкіндік береді. Алынған нәтижелер жабайы өсетін флораны сақтау және табиғи ресурстарды қалпына келтіру мақсатымен тұқымдар банкін жасауда маңызды саты болып табылады [9].

1.1.2 Өсімдік материалын криосақтаудың ерекшеліктері

Қазіргі кезде клетка ұлпалары мен мүшелерді терең мұздату медицина мен мал шаруашылығында кең қолданылуда. Криосақтаудың қиыншылықтары өсімдік клеткаларының ерекшеліктерімен байланысты: өлшемі үлкен, вакуольдерінің болуы, судың көп мөлшері. Мұздату және қайта ерітіп алу кезінде клеткалардың осы ерекшеліктері арқасында клетка мембраналары күшті зақымдалады. Мұздату кезінде клетканың өлуі бірнеше себеппен болады. Клеткалардың зақымдалуы клетка ішінде де, сыртында да мұз кристалдарының түзілуімен байланысты. Мұз кристалдары алдымен клетка сыртындағы ерітіндіде, яғни клетка сыртындағы кеңістікте пайда болады. Цитоплазманың қату нүктесі -10C, алайда клеткалар -100C-150C-қа дейін қатпайды, өйткені плазмалемма клетка сыртында түзіліп жатқан мұз кристалдарының клетка ішіне өтуіне кедергі жасап тұрады. Клека ішінде мұз кристалдарының түзілуі клетканың мембранасын зақымдайды [2].
Егер температура баяу төмендесе, клеткадағы бос сулар клетка сыртына шығып, сыртқы кеңістікте түзіліп жатқан мұз кристалдарына қосылады. Жылдам мұздатқан кезде дегидратация процесі жүрмей, бос су клетка ішінде, яғни цитоплазмада мұз кристалдарына айналады. Баяу мұздату кезінде клетка ішінде мұз кристалдары мүлдем түзілмеуі мүмкін, алайда бұл кезде протоплазманың қысылуы және күшті дегидратация процесі жүреді. Клетканың сусыздануы мұз түзілуі нәтижесінде клетка сыртындағы ерітіндінің концентрленуінен жүреді. Плазмолиз және ол тудырған осмостық стресс клетканың өлуіне әкеліп соғады [10].
Криозақымдалудың 2 факторлы гипотезасы бар. Бірінші фактор – мұздың түзілуі (мұздың клеткаішілік кристалдары тез мұздатқанда механикалық зақым келтіреді). Екінші фактор – мұздың түзілуімен байланысты клетканың сусыздануы, осмостық стресс.
Әртүрлі зерттеулерде осмотикалық зақымдалу эффектісі клетка ішіндегі көлемнің азаюымен, клетка сыртындағы және клетка ішілік заттардың концентрациясы, рН өзгеруі және ферменттердің активтілігімен байланысты деп көрсетіледі.
Бұл мәселені шешу үшін өсімдік ұлпаларын криоқорғаудың екі негізгі стратегиясы ұсынылады:
– криоқорғайтын заттарды қосу,
– қатуға, мұзға айналуға қабілетті судың көп бөлігін буландыру жолымен жою.
Бұл екі стратегияның мақсаты – ұлпалардағы мұздың түзілуін азайту немесе болдырмау [11].
Плазмолизге ұшыраған клетка

Мұз кристаллдары
А) Б)
Сурет 1. Клеткаларды мұздату: А) Жылдам, Б) Баяу

Криосақтаудағы барлық тәсілдер осы зақымдаушы екі факторды баланстауға бағытталған.
Терең мұздату үшін әр түрлі клеткалар, ұлпалар мен мүшелер, каллус және суспензиялық культуралар, протопласттар, эмбриоидтер, тұқымдар, сонымен қатар апикальды меристемалар қолданылады.
Дәл осы апикальды меристемалар өсімдіктердің регенерациясын қамтамасыз етеді, өйткені бұлар бастапқы өсімдіктердің дәл генетикалық көшірмелері болып табылады.
Апикальды меристемаларды in vitro жағдайда қоректік орталарда өсірілетін асептикалық өсімдіктерден, өркендерден бөліп алады.

1.1.3 Өсімдік клеткаларының төмен температураларға бейімделу жолдары

Мұздатудың өсімдік организмінің құрылымдық және функционалдық бүтіндігіне әсерін зерттегенде, төмен температура өсімдік құрылымының әр түрлі деңгейінде комплексті өзгерістер тудыратыны анықталды.
In vivo жағдайда табиғи суыққа төзімділік пен in vitro жағдайда криотөзімділік бойынша әр түрлі зерттеу нәтижелері өсімдіктер клеткаларында гипотермия кезінде, төмен температуралық факторға бейімделуге бағытталған белгілі бір механизмдер әсер ететінін көрсетеді [7].
С.В.Климовтың статьясында [12] өсімдіктер құрылымының әртүрлі деңгейлерінде (организмнен молекулалық деңгейге дейін) өсімдіктердің төмен температураға бейімделуінің әртүрлі жолдарын бір стратегия аясында қарастырған.
Организм деңгейінде бұл стратегия кеңістік пен уақытта өсімдіктердің бейімделіп орналасуы арқылы іске асады. Бұл активті және пассивті қорғаныс