Дипломдық жұмыс: Биология | Азот тотығының бидай алейрон клеткаларының программаланған өліміне әсері

Мазмұны

КIРIСПЕ……………………………………………………………………….…....5

1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ………………..…………….…………………………....6
1.1 Астық тұқымдастарының алейрон қабаттары.......... .................................6
1.2 Гиббереллин қышқылының метаболизмі.................................................... 8
1.3 α-амилазаның функциясы мен құрылысы.................................................11
1.4 Азот тотығы……………..………………………………………....................13

2 ЭКСПЕРИМЕНТТІК БӨЛІМ...........................................................................16

2.1 МАТЕРИАЛДАР МЕН ЗЕРТТЕУ ӘДІСТЕРІ....….....……………..….....16
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу…..............16
2.1.2 Бидай дәнінің жекелеген қабатын инкубациялау шарттары.....16
2.1.3 Сутегінің асқын тотығының мөлшерін анықтау ……...…...…..17
2.1.4 Клеткалық және секрецияланған α-амилаза ферменттерін экстракциялау және олардың белсенділігін анықтау.................17
2.1.5 ДНҚ-ны бөліп алу әдісі……………..…………................................18

3 НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ.……………………….... ..19

4 ҚОРЫТЫНДЫ..……………………………………………………….……......25

5 ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТIЗIМI……………………………..…...26
КIРIСПЕ

Бидай дәнінің өнуі барысында оның алейрон қабаты бірқатар гидролитикалық ферменттерді (соның ішінде α-амилазаны ) синтездеп, оларды секрециялайды. Бұл гидролазалардың синтезінің индукциясы ұлпада гиббереллин қышқылының (ГҚ) болуына тәуелді. Гиббереллинге – тәуелді гидролазалардың синтезі осы фитогормонның табиғи антагонисті болып табылатын – абсциз қышқылымен (АБҚ) тежеледі [1].
Дәннің алейрон қабатындағы клеткалар онтогенездің келесі кезеңдерінде элиминацияға ұшырайды. Алейрон қабатындағы клеткаларының осы өлімі программаланған сипатта жүреді, яғни генетикалық жағынан детерминацияланған деген болжам бар (апоптоз) [2;3].
Алғашқы жұмыстарымызда біздер бидай дәнінің алейрон қабатындағы және эндосперіміндегі клеткалардың программаланған өлімінің (КПӨ) морфо – биохимиялық белгілері анықтап, сипаттаған болатынбыз [4;5]. Бидай дәнінің алейрон қабатындағы КПӨ-ң орындалуы барысында супероксид (О*), сутектің асқын тотығы (Н2О2) сияқты оттегінің белсенді түрлерінің (ОБТ) және антиоксидантты ферменттік жүйелердің (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза, каталаза және т.б. ) маңызды рөл атқаратындығы анықталған [6].
КПӨ-ң реттелуінде азот тотығының (NO) маңызды рөл атқаратындығы белгілі [6]. NO- газтәрізді бос радикал, клеткааралшық зат пен плазматикалық мембранадан оңай диффузияланады. Ол клеткаішілік мессенджерлік жүйенің бір бөлігі бола тұра, NO- ң жануарлар жүйесіндегі физиологиялық үрдістеріне кең көлемді әсер ету қасиетімен ерекшеленеді [7].
Қазіргі кезде әдебиеттерде жинақталған мәліметтерге қарағанда, NО сонымен қатар өсімдіктерде жүретін көптеген физиологиялық үрдістерге қатысатындығын көрсетеді: патогенге жауап реакциясы, өніп-өсу, фитогормондардың мөлшері, сонымен қатар КПӨ (апоптоз). [8]. Соя клеткаларының культурасында NO мен ОБТ арасындағы әрекеттесу нәтижесінде КПӨ-нің орындалатыны белгілі болды. NO жеке өзі клеткалардың өлімін индукциялай алмайды, сонда КПӨ-нің жүзеге асуы NO: супероксид қатынасы арқылы детерминацияланатыны көрсетілген.
Осы мәліметтердің барлығы өсімдіктер клеткасында программаланған өлімнің жүзеге асуы барысында NO ОБТ-ң клеткадағы мөлшерін реттеуде маңызды рөл атқаратындығын дәлелдейді.
Осыған орай бұл жұмыста біздер клеткаішілік оттегі радикалдарының мөлшерін реттеудегі NO рөлін зерттедік. Бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткалардың функционалдық белсенділігінің реттелу механизмдері қарқынды зерттеліп жатқанымен [1-3], әлі секреторлық белсенділікті бақылауда және клеткалардың өліміндегі азот тотығының рөлі толық анықталмаған, тіпті зерттелмеген деуге болады.


1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

1.1 Астық тұқымдастарының алейрон қабаттары

Астық тұқымдастарының алейронын зерттеу кем дегенде екі ғасырға созылып келеді. Астық алейроны өсімдіктердің ең қарқынды түрде зерттеліп келе жатқан ұлпаларының бірі болып табылады. Сыра қайнатуда және ашытқы дайындауда астық алейроны маңызды орын алатындықтан химия және биология мамандары шамамен 200 жыл бұрын арпаның маңызын егжей-тегжейлі зерттей бастады [9].

ЕСКЕРТУ: АЛ. – бидай дәнінің алейрон қабаты; ЭНД. – бидай дәнінің крахмалды эноспермі; ПРОК. – бидай дәнінің проксимальды бөлігі; ДИСТ. – бидай дәнінің дистальды бөлігі. 3 – бидай дәнінің ұрығы

Сурет 1- Бидай дәнінің құрылысы
Бидай дәнінің эндоспермі тозаң қапшығында, орталық клетканың аталық жыныс клеткасымен ұрықтану нәтижесінде пайда болатын, триплоидты ұлпа (1-сурет). Тозаңдану процесінен кейін шамамен 8-10 тәуліктен соң, дән эндоспермі крахмалды эндоспермге және алейрон қабатына дифференциацияланады [10]. Алайда, ұрықтанған бір клеткадан пайда болатынына қарамастан, алейрон ұлпасы мен крахмалды эндосперм клеткаларының өлуі әртүрлі уақытта жүзеге асады. Крахмалды эндосперм клеткалары бидай дәнінің пісіп-жетілу барысында өліп, дән қуысын белокты және крахмалды гранулалар түрінде толтырып тұрады деген болжам бар. Ал алейрон клеткалары, дәннің пісіп-жетілу сатысында еш өзгеріссіз сақталып, тек қана оның өніп-өсу сатысын, гидролитикалық ферменттерді синтездеп, секрециялау арқылы индукциялағаннан кейін ғана элиминацияланады [11].
Алейрон қабатының онтогенетикалық программаланған клеткалар өлімі (ПКӨ) апоптотикалық сипатта жүзеге асатыны анықталған [12-14]. Бұл процестің дезоксирибонуклеазалардың белсенділігінің артуымен, геномдық ДНҚ молекуласының фрагментациялануымен үйлесіп, фитогормондар - гиббереллин және абсциз қышқылдарымен бақыланылатыны көрсетілген [15].
Жоғарыда айтылғандай, алейрон клеткаларының негізгі қызметі гидролитикалық ферменттерді (α-амилазаны қоса) синтездеп, крахмалды эндоспермге секрециялау.
Алейрон клеткаларының ультра құрылымы олардың қызметін көрсетеді. Дәндегі алейронның көптеген көрсеткіштері оның ерекше және жан-жақты тәжірибелік жүйе болуын қамтамасыз етеді. Астық тұқымдастарының алейрон қабаты біртекті, жоғары дифференциалданған клеткалардың бір қабатынан (сұлы, жүгері, қара бидай, бидай) немесе бірнеше қабатынан (күріш, арпа) тұрады [16]. Пісіп-жетілген, құрғақ алейрон клеткалары қалың, геммицеллюлозалық қабырғамен қоршалған және олар ешқандай да клеткалық бөлінуге ұшырамайды. Алейрон қабаттарын жабысып қалған өлі крахмалды эндоспермнен ажыратып алуға болады және ажыратып алынған алейрон ұлпасынан ферменттердің көмегімен протопластардың біртекті популяциясын дайындауға да болады [17]. Осындай жолмен жекеленіп алынған протопластар, тұтас алейрон ұлпалары сияқты гиббереллинге тәуелді α-амилаза изоферментінің активтенуі және синтезін қамтамасыз ететіні көрсетілген. Жекеленген протопластар алу әдістемесі сұлы және арпа алейрон ұлпасына қатысты жасалынған [18] Біздің лабораторияда бидай алейрон ұлпаларынан жекеленген протопластарды бөліп алудың және тазалау, оларды концентрлеу үшін фракциялаудың модификацияланған әдістемесі ұсынылған [19]. Ферменттік өңдеу арқылы алынған бидай алейрон протопластарының шығымы шикі ұлпаға шаққанда –35х106 клетка/1 г болды. Протопластарды фиколл градиенттінде центрифугалау әдістемесі тіршілік дәрежесі жоғары клеткалар фракциясын алуға мүмкіндік берді (шамамен 80-85 %).
Алейрон клеткаларының цитоплазмасына белоктар қорынан тұратын көптеген вакуольдер тән, оларды көбінесе алейрондық түйіршіктер деп те атайды, олар бүкіл клеткаларды алып жатады. Бұл органелла алейронның гормондар әсеріне қайтаратын реакциясында негізгі қызмет атқарады. Протеиндердің қоры бар вакуольде гиббереллинмен өңделгеннен кейін гидролизге ұшыраған протеиндерді секреторлық белоктардың түзілуіне қажетті аминқышқылдармен қамтамасыз ету үшін қор ретінде сақтай бастайды [20]. Протеиндердің қоры бар вакуольдер, сондай-ақ, астық тұқымдастардың дәндеріндегі минералдардың негізгі қоймасы болып табылады. Олардың құрамынан минералдар фитин түрінде бөлініп алынған. Фитин К+, Mg2+, және Ca2+ иондары мен фитинді қышқылынан (гексофосфат) түзілген кристалды, ерімейтін комплекс болып табылады. Бұл кристалды қосынды, глобоид деп те аталады. Рентгендік микроанализ нәтижелері бойынша дән құрамындағы РО43+, К+, Mg2+ және Ca2+ иондарының шамамен 75% алейрон қабаттарында сақталады [21]. Алейрон немесе протопластардың инкубациялық кезеңінде вакуольдер көлемдері ұлғайып, бір-бірімен орталық үлкен бір вакуоль түзілгенше қосыла бастайды. Инкубациялық ортада гиббереллин болған жағдайда клеткалар мен протопластардағы алейрон қабаттарының вакуольдену процесі жылдамдай түседі. Бейтарап майларды сақтайтын липидтік қосындылар немесе олеосомдар да алейрон клеткаларының маңызды органеллалары болып табылады, олар клетканың бүкіл кеңістігінің 30% алып жатқан үшглицеридтік негізден тұрады [22]. Алейрон клеткаларындағы олеосомдар эндоплазмалық торда пайда болып, кейіннен эндоплазмалық торға және протеиндердің қоры бар вакуольдер бетіне бекінген күйде болады. Олеосомдардың вакуольдер бетіне бекініп жатуы вакуолдердің кейбір түрлері тікелей эндоплазмалық тордан пайда болады деген болжамды растайды. Қор ретінде сақталған бейтарап майлар алейрон клеткаларын көміртегі көзімен де қамтамасыз етеді, эндоспермді мобилизациялау басталғанға дейін клетка көміртегіні осы жерден жұмсай алады, сонымен бірге мұндағы май қышқылдары мембрананы түзуге пайдаланылады. Бұл май қышқылдарының алейрон клеткалары арқылы метаболизденетініне бірнеше дәлелдер бар. Алейрон клеткаларында малатсинтетазадан және изоцитрат лиазадан тұратын көптеген глюкоксисомалар да болады [23;24] және оқшауланып алынған алейрон қабаттары сахарозаны синтездей алады.
Жоғарыда айтылғандай, алейрон клеткалары – жоғары деңгейде дифференциацияланған ұлпа. Бұл ұлпаның негізгі қызметі – гидролитикалық ферменттерді (альфа-амилазаны қоса) синтездеп, крахмалды эндоспермге секрециялау. Олай болса, алейрон ұлпаларында оның секреторлық қызметіне байланысты эндоплазматикалық тор, Гольджи аппараты, митохондриялар өте жақсы дамыған.
Аталған гидролитикалық ферменттердің ішінде α-амилаза, дәннің өніп-өсуіне қатысты маңызды болып табылады. Крахмалды эндоспермге секрецияланған α-амилаза крахмалды қанттарға дейін ыдыратып, өсімдіктің өніп-өсуіне қажет энергиямен қамтамасыз етеді [25;26].
α-амилаза ферментінің практикалық маңыздылығына байланысты (ауыл-шаруашылығы, сыра дайындау, нан өндіру, фармакология және т.б.) оларды зерттеу жұмыстарына ғалымдар ертеден көңіл аударуда. Осыған орай альфа-амилаза ферментінің құрылысы мен қызметі келесі бөлімде терең қарастырылады.


1.2. Гиббереллин қышқылының метаболизмі

Гиббереллиндер – химиялық тұрғыдан табиғаты дитерпеноидты биологиялық активті қосылыстарға жатады. Олар барлық зерттелген жоғарғы сатыдағы өсімдіктердің ұлпаларында табылған. Қазіргі кезде гиббереллиндер қарқынды зерттелуде, себебі олар өсімдік организмдеріндегі алуан түрлі физиологиялық процестерді реттеуге қатысады [27-29].